Epiview深度解读 Science ： circRNA在大脑中的潜在功能！
当 RNA 咬住了自己的尾巴，变身环形 RNA（circular RNA，以下简称 circRNA）之后，会有怎样特殊的功能呢？跟随小编的步伐，简单回顾 circRNA 的研究历程，接着深入剖析 8 月 10 日在上 online 的一篇关于 circRNA 的文章，了解 circRNA 的功能和研究范式，最后对今后可能的方向进行展望。
这篇Science首先在小鼠和人脑组织切片中验证了 miR-7 和 miR-671 可按照不同的方式结合 circRNA Cdr1as，接着通过 CRISPR/Cas9 技术敲除Cdr1as的一个基因座制造杂合突变小鼠，选取 4 个脑区进行分析，发现 miR-7 显著下调，miR-671 显著上调，此外 miR-7 的靶基因显著上调；这些基因表达异常可影响兴奋性突触传递过程，进而导致小鼠前脉冲（PPI）障碍。PPI 在症等多种神经性疾病中，提示 circRNA Cdr1as 在这些疾病中的潜在功能。
1864 年，青年化学家凯库勒研究苯环的结构已经三年，依然没有突破。寒冬中的一天晚上，凯库勒坐在桌前写教科书，写的有些累了，他把椅子转向炉火，打起瞌睡。在梦中，原子在凯库勒眼前跳跃，大的、小的、成串的。突然成串的原子旋转起来，像蛇一样咬住自己的尾巴！看！有一条蛇咬住了自己的尾巴，这个形状在眼前旋转不停。电光一闪，凯库勒从梦中惊醒。苯的结构为什么不能是环状的呢！1865 年，凯库勒发表了苯的六元环结构，这是有机化学中里程碑式的发现。
中心中，遗传信息从 DNA 流向 RNA，接着流向蛋白质。RNA 似乎只是一个遗传信息的“快递员”，但越来越多的研究发现 RNA 的功能异常丰富，远不止“快递员”这么简单，尤其是大量非编码 RNA（noncodingRNA, ncRNA）。但我们所熟知的 ncRNA，比如 miRNA、siRNA、lncRNA、piRNA 等，在印象中都是线性的。是否也存在可以咬住自己尾巴的环形 RNA 呢？
确实存在，而且存在了很多年。早在 1976 年的时候，科学家们就已经发现了 CircRNA，但当时误以为是类病毒；1979 年，才搞清楚这是内源性 RNA 剪接的产物；此后的几十年，人们一直认为 CircRNA 是可变剪接出错的结果，没有给予太多重视。直到近 5 年，CircRNA 才逐渐火热起来！
2013 年出现了六篇重要文章。其中包括三月份的两篇重量级Nature文章：Memczak 等了 CircRNA 具有调控潜能；而 Hansen 等直接给出答案，CircRNA 可以作为 miRNA 海绵。随后的几个月，有文章系统性地分析了 CircRNA 在阿尔兹海默症以及癌症中的关键功能，这让 CircRNA 大显！很快有团队建立了 CircRNA 与疾病相关的数据库 Circ2Traits。之后 CircRNA 的研究呈指数增长，目前还在飞速发展中。
值得一提的是，中科院上海计算生物所的杨力研究员和生化细胞所的陈玲玲研究员（还是令人羡慕的夫妻）对 CircRNA 领域贡献颇丰。2014 年，杨力和陈玲玲老师开发了 CIRCexplorer，在人源胚胎干细胞 H9 中发现近万条 circRNA，首次证明了内含子 RNA 互补序列介导的外显子环化。近几年，陈玲玲老师和杨力老师持续发力，贡献了诸多重要的。
目前通常认为，CircRNA 是一类单链的环形 RNA，由 pre-mRNA 反向剪接（back-splicing）形成，通常含有 1~5 个外显子，可归入长链非编码 RNA 之列。CircRNA 的功能主要包括：(1) 可作为 miRNA 海绵，即一个 CircRNA 上具有很多个 miRNA 结合位点；(2) 可调控过程；(3) CircRNA 合成过程可影响可变剪接。此外，有研究报道 CricRNA 可影响 mRNA 的稳定性，甚至可翻译为蛋白发挥功能。
miRNA 可靶向与其互补的 mRNA，并在 Ago2 蛋白的作用下，对 mRNA 进行剪切。Ago2 介导的 mRNA 沉默过程会产生 miRNA-target RNA-Ago2 的嵌合体。通过 CLIP-Seq 技术，在小鼠和人类死亡的大脑中鉴定了上万个嵌合体。对 miR-7 嵌合体中的靶序列进行分析和排序，发现无论是在人类还是小鼠大脑中，排在第一位的都是Cdr1as。
值得注意的是，小鼠大脑中的嵌合体数据分析显示，与 miR-7 结合的 RNA 中排在第二位的是 lncRNA Cyrano。Cyrano 中包含一个几乎可以完美地与 miR-7 的结合位点，并且该位点高度保守，这也提示 lncRNA Cyrano 在中枢神经系统中对 miR-7 具有重要的调控作用。
那么 Cdr1as 在大脑中的表达模式是怎样的呢？这里用到了 RNA-FISH（荧光原位杂交），对不同的神经细胞用不同的荧光标签进行区分，发现在皮质切片中 Cdr1as 只在神经元中高表达，而且主要集中在兴奋性神经元中；而在神经胶质细胞（少突胶质细胞和星形胶质细胞）中不表达。
在不同的脑区中，比如前额皮质、海马、中脑和后脑，表达 Cdr1as 的绝大多数神经元都是 vGluT1 和 vGluT2 阳性的；在小脑中，Cdr1as 也只在含有大量兴奋性神经元的颗粒层中表达，而不在层中的 GABA能神经元（GABAergic neurons）和浦肯野细胞中表达。
进一步利用单 RNA FISH，在原代皮层神经元中发现 Cdr1as 不仅出现在神经元胞体中，还出现在突起（neurites）中，这说明在不同的亚细胞定位中，Cdr1as 都会有潜在的生物功能。
如何研究一个 CircRNA 的功能呢？在人类和小鼠大脑中，Cdr1as 可有效地环化，检测不到线性的本。CircRNA 非常稳定，半衰期很长，在水平上实现沉默有一定难度。最直接的策略是用 CRISPR/Ca9 敲除 Cdr1as 的基因座，制造功能缺失的小鼠模型。
但这种策略可能会影响另一条链的，让情况变得更加复杂。为了评估另一条链的表达情况，作者利用可以与 Cdr1 mRNA 互补的探针对小鼠的 4 个脑区进行检测，进行原位杂交实验，分析已经发表的 RNA-seq、CAGE 和染色质修饰数据。在小鼠的大脑、特定的脑区或者其他小鼠和人类组织中，都没有检测到 Cdr1as 反向互补链的。这说明用CRISPR/Ca9 敲除 Cdr1as 的基因座是可行的。
Cdr1as 位于 X 染色体上，因此在分析敲除的小鼠之前，需要先搞清楚在野生型（WT）雄性和雌性、以及杂合子雌性小鼠大脑中 Cdr1as 的表达情况。qRT-PCR 实验结果显示， Cdr1as 在野生型雄性和雌性小鼠中几乎一样，而杂合子雌性小鼠中 Cdr1as 的水平降低到 WT 的一半。
之前在细胞系中，已经发现 miR-1 和 miR-671 可结合到 Cdr1as。但是在脑中是否也是这样呢？本文选取了高表达 Cdr1as 的小脑、皮质、海马和嗅球等 4 个主要脑区进行 miRNA seq。比较 WT 和 KO 小鼠 4 个脑区中的 miRNAseq 数据，并结合 Northern blot，发现 miR-7 在 KO 小鼠中显著下调。更加具体的情况是，miR-7a-5p 和 miR-7b-5p（它们的种子序列相同，成熟的 RNA 序列略有差别）在所有的脑区中均下调。
与 miR-7 相反，在 KO 动物的小脑、皮质和嗅球中，miR-671-5p 表达上调。跟 miR-7 类似，KO 小鼠中这种上调也是高度性的，而且除了 miR-671，没有发现其他显著上调的 miRNA。此外，miR-671-5p 的表达上调也是后的。在 KO 小鼠和野生型小鼠提取出的 RNA 中用 Northern blot 检测，虽然 miR-671-3p 可以检测到而且没有发生改变，但却没有检测到成熟的 miR-671-5p。为何 miR-671-5p 及其前体 RNA 这么难检测到呢？一是成熟的 miR-671 表达量很低，而且在实验中不稳定；二是前体 RNA 加工自Chpf2本的编码序列中。
此外，在非脑组织中分析 Cdr1as、miR-7、miR-671 的表达，包括肺、骨骼肌、脾脏、心脏、脊髓。在脾脏中，Cdr1as 检测不到，但是 miR-7a 稳定表达，其他组织显示出非常低的 Cdr1as 表达量，而 miR-7a 的表达在 Cdr1as 去除后并没有改变。miR-7 表达唯一发生改变的非脑组织是脊髓，这也是唯一可以检测到 Cdr1as 表达的非脑组织。
这些数据说明，在非脑组织中 Cdr1as 的缺失并不影响 miR-1 和 miR-671 的表达；而在神经组织中，miR-7 的下调则依赖于 Cdr1as 的缺失。
miRNA 通过调控其靶基因进而影响个体的表型，这应该说是比较常规的套了。在 4 个脑区中检测 miRNA 的同时做 mRNA-seq。在皮质、小脑和嗅球中，一些保守的 miR-7 靶基因显著上调，包括Fos、Nr4a3、Irs2、Klf4。此外，可与 miR-7 相互作用的lncRNA Cyrano 在 KO 小鼠的 4 个脑区中都高表达。
进一步对这些上调的基因进行审查，发现了一些显著的IEGs，比如Fos、Arc、Egr1、Egr2、Nr4a3等。用同一只动物和另外的动物中的皮质和海马，通过 qRT-PCR 和 Nanostring 进行验证，确认了所有的候选基因中，即早基因的蛋白表达水平升高。其中c-Fos、Egr1、Arc 等通过 Western Blot 检测，进一步通过免疫组织化学验证c-Fos和Egr1在大脑切片中的表达。在四个脑区中对c-Fos的免疫组化结构进行定量，发现在 KO 小鼠中，表达c-Fos的神经元的数量增多，而且c-Fos信号强度更强。
miR-7 是细胞周期和 IEGs（比如Fos）的因子，提示了 Cdr1as 的去除与 IEGs 表达上调间的联系；第二，此前研究表明，IEGs 的表达上调与神经元的活性增加密切相关，因此暗示了 Cdr1as 导致的 IEGs 的上调可能会影响动物的行为。
在 KO 小鼠的非脑组织中，IEGs 的表达水平没有改变，说明 IEGs 表达上调是大脑依赖的，而且与 Cdr1as 的水平密切相关。除了 IEGs，在 KO 小鼠大脑中，还发现了一些差异表达的生物钟基因，比如Per1和Sik1相应地上调，而Dbp相应地下调。此前研究发现，在前脑中，这种表达的模式与睡眠与持续性相关。
Cdr1as 缺失后，在突触水平到底会产生什么生理学结果呢？利用单海马神经元研究兴奋性突触后电流（excitatory postsynapticcurrents，EPSCs）。结果发现，在 KO 小鼠的神经元中，自发性的囊泡显著上调，微小兴奋性突触后电流频率（而不是振幅）加倍。通过分析钙离子诱发的突触反应，发现 KO 与 WT 小鼠神经元相比，兴奋性突触后电流的振幅并没有显著不同。
虽然计算得到的囊泡概论没有发生显著改变，但是 KO 小鼠对两个连续刺激的响应，以及对 10Hz 的动作电位序列的响应与 WT 小鼠显著不同。
这些结果反应了在 KO 小鼠神经元正在进行的突触活动中囊泡置换活性发生改变，以及在突触响应中显示出更强的作用。总的来说，Cdr1as 的缺乏可导致兴奋性突触传递的失调，潜在的机制包括突触蛋白表达的变化、突触特化异常、突触钙稳态的改变。
小鼠行为上有什么具体体现呢？分别对 WT 小鼠和 KO 小鼠进行行为学实验。KO 小鼠的社会活动、焦虑水平、不受干扰的自发活动、在认知记忆或探索行为方面都没有显著的缺陷，但是唯独惊吓反应测试中，在三个不同的前脉冲强度下，前脉冲（prepulse inhibition，PPI）显示出很强的差异。
PPI 指惊吓反射中在惊吓刺激（脉冲)之前给予轻微刺激(前脉冲)可以动物对刺激反应的现象。PPI 是感觉运动门控水平的标志之一。症患者感觉运动门控，从而导致信息超载出现和妄想症状，同时伴有 PPI 的降低，PPI 是认知障碍的可测量的指标之一。（本段解释来自于《认知障碍的前脉冲模型》）
总的来说，Cdr1as 的敲除显示出与神经疾病相关的表型，比如 PPI 受损，而且IEGs 很有可能参与其中。这些结果为今后的研究提供了很好的参考价值，也提供了很多可供挖掘的线索。
第一，这篇文章建立了 CircRNA 与神经性疾病间的联系；第二，本文做的是热点领域 CircRNA，而且阐明了一种特定的 CircRNA Cdr1as 在哺乳动物脑中的功能；第三，本文提供了很多后续研究的线索；第四，本文内容详实，大量的炫酷的荧光图应该也是一个加分项。
3. 文章到底提供了哪些可以后续研究的线) 文章附表中给出了与 miR-7 结合排在前 10 的 RNA，本文研究的只是排在第一的Cdr1as，而且提到了排在第二的 lncRNA Cyrano 也可能具有很重要的作用，因此 Cyrano 到底在哺乳动物大脑中发挥什么功能呢？这绝对常有潜力的一个点。
(2) KO 小鼠中，一批 IEGs 上调，这些 IEGs 上调与小鼠的 PPI 表型之间到底有什么关系？哪几个 IEGs 起到关键作用？具体的通又是怎样的？
(3) KO小鼠大脑中，miR-7 表达下调后，不仅仅是 IEGs 受到影响，还有很多非 IEGs 的基因也差异性表达，那么这些基因的差异性表达又会产生哪些影响呢？
(4) miR-7、miR-671、miR-200 家族等都与肿瘤密切相关，Cdr1as 如何通过这些 miRNA 介导肿瘤的发生发展，这也是一个具有前景的方向。
Nikolaus Rajewsky 于 1997 年获得科隆大学（University of Cologne）理论物理博士学位，随后在美国罗格斯大学（Rutgers University）从事计算物理学博士后研究，第二轮博后他去了洛克菲勒大学的物理与生物学研究中心；2003 年获得纽约大学教职，任生物学和数学助理教授。2006 年，他回到，出任马克斯•德尔布吕克研究中心（Max Delbrück Center）生物信息学研究的带头人。
•德尔布吕克命名的。马克斯•德尔布吕克（Max Delbrück）是一位德裔美籍生物物理学家，1969 年因为噬菌体方面的杰出研究与阿尔弗雷德 • 德 • 赫希（Alfred Day Hershey）以及萨尔瓦多 • 爱德华 • 鲁利亚（Salvador Edward Luria）共同获得诺贝尔生理学或医学。特别说明：第一段中关于凯库勒的故事有想象成分，此外凯库勒在苯的六元环发现过程中的贡献还有争议。
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